NovaSeq^TM X/X Plus, NovaSeq^TM 6000和iSeq^TM 100测序平台使用的是有一定数量纳米孔的patterned flowcell，文库在孔中进行簇生成。正是由于这一特点，当比较同一测序平台的测序结果时，不同批次测序之间的原始簇密度是相同的。为了优化这三个平台测序平台的上样浓度，可以通过Sequencing Analysis View™ (SAV)软件绘制% Occupied和% Pass Filter的散点图来确定测序时上样浓度属于过低、最佳，还是过高。可以按照下面的说明绘制这些指标的散点图并根据散点图结果优化文库上样浓度。

若要查看“% Occupied”数据，NovaSeq 6000需要SAV版本在v2.4.5以上，iSeq 100则需要SAV 版本在v2.4.7以上。NovaSeq X/X Plus需要SAV版本为v3.0，该版本同时可以查看NovaSeq 6000和iSeq 100的指标。SAV安装程序可以从 Sequencing Analysis Viewer Support 页面下载

关于SAV v2.4.x 如何创建% Occupied和% Pass Filter散点图的视频教程可以在这里找到。
注: % Occupied这一指标不适用于Illumina其他测序平台的数据。

利用SAV v2.4.x绘制% Occupied和% Pass Filter的散点图：

1. 将运行数据加载到SAV中，并选择Imaging选项卡:

2. 从工具栏中选择散点图绘图工具，弹出一个绘图窗口。

3. 在窗口右侧的Data选项卡中，“X Values”选择“% Occupied”，“Y Values”选择“% Pass Filter”。散点图将自动生成。

利用SAV v3.0绘制% Occupied和% Pass Filter的散点图：

1. 将运行数据加载到SAV中，并选择Imaging选项卡:

2. 在Imaging选项卡中选择Custom Plots。

3. 在Custom Plots中确保Scatter plot选项被选择。

4. X Values选择 %Occupied。

5. Y Values选择 % Pass Filter。

6. 可选: 可以通过Color By下拉菜单，在相应选项下对散点图上的点进行标记。

评估散点图：

上样浓度过低:

• 从图的左下到右上，点落在一条斜率为正的直线上，% Occupied和% Pass Filter的变化幅度较大
  

最佳上样浓度:

• 在散点图中，点聚集为一堆具有正斜率的点，% Occupied和% Pass Filter的变化幅度较小
  

上样浓度过高:

• 点有一些轻微的负斜率、接近垂直，并且% Occupied高达90以上， % Pass Filter的变化幅度较大
  

如果散点图显示上样浓度过低或者过高，则需要分别提高或降低上样浓度，以达到最佳上样浓度。如果散点图显示的是最佳上样浓度，那么在未来测序时类似大小的同一类型的文库可继续使用此上样浓度。

更多信息，请参考Cluster Optimization Overview Guide。