Debido a las diferencias en química y hardware, las librerías exhiben diferentes eficiencias de agrupamiento en diferentes plataformas de secuenciación de Illumina. La migración de librerías entre plataformas requiere la optimización de la densidad del clúster específica del instrumento.
Se muestran todas las directrices para determinar la concentración de carga de una librería que se está migrando de una plataforma de secuenciación de Illumina a otra:
- Entre las plataformas HiSeq™ y MiSeq™
La generación de clústeres en la plataforma MiSeq y la plataforma HiSeq en modo de carrera rápida generalmente produce una densidad de clúster de aproximadamente un 15% a un 20% mayor en comparación con la misma librería en la misma concentración agrupada en una High Output flow cell.
- Entre las plataformas MiniSeq™ y NextSeq™ 500/550
Las plataformas MiniSeq y NextSeq 500/550 utilizan químicas similares para la generación de clústeres. Como resultado, se puede esperar que la misma librería se agrupe a una densidad similar.
- Entre las plataformas HiSeq/MiSeq y MiniSeq/NextSeq 500/550
Las plataformas MiniSeq y NextSeq 500/550 requieren densidades de clúster significativamente más bajas que las plataformas HiSeq y MiSeq. Por lo tanto, es importante rehacer la optimización de la densidad del clúster al migrar una librería de MiSeq o HiSeq a la plataforma MiniSeq o NextSeq 500/550 y viceversa.
- Hacia o desde HiSeq 3000/4000 y NovaSeq 6000
El proceso de generación de clúster de las patterned Flow cells en los sistemas HiSeq 3000/4000 y NovaSeq 6000 difiere de los sistemas de non-patterned flow cells. Por lo tanto, la optimización de la densidad del clúster se debe realizar al migrar una librería desde cualquier otro sistema a las plataformas HiSeq 3000/4000 o NovaSeq 6000, y viceversa.
Cuando se utiliza NovaSeq Control Software versión 1.2 y superior, las librerías optimizadas previamente en la plataforma HiSeq 3000/4000 se cargan con la misma concentración en la plataforma NovaSeq 6000. Optimice las concentraciones de carga posteriores en función del porcentaje de passing filter de las métricas primarias y el porcentaje de duplicados (duplicates) del análisis secundario; consulte Cluster Optimization Overview Guide y el boletín Plotting % Occupied by % Pass Filter to optimize loading concentration for NovaSeq 6000 and iSeq 100 platforms.
- Desde iSeq ™ 100 hasta NovaSeq 6000
Antes de realizar una secuenciación in-depth de la librería en el sistema NovaSeq 6000, la secuenciación superficial en el iSeq 100 puede proporcionar un control de calidad rápido y económico; consulte la nota de aplicación Sequencing Library QC with the iSeq System y el boletín Step-by-step instructions for sequencing library QC with the iSeq 100 System. Al cuantificar la librería antes de secuenciar en NovaSeq 6000, reequilibrar el pool de librerías en función de las lecturas actuales de iSeq es tan consistente como usar los datos de qPCR.
Además, para el flujo de trabajo NovaSeq Xp, se espera que la concentración de carga de la librería sea 2.2x – 2.5x la concentración del sistema iSeq 100, y para el flujo de trabajo estándar NovaSeq 6000, 3.3x – 4x la concentración del iSeq 100. Optimiza concentración de carga posterior basada en el porcentaje de ocupación de la carrera y el porcentaje de passing filter; consulte el boletín Plotting % Occupied by % Pass Filter to optimize loading concentration for NovaSeq 6000 and iSeq 100 platforms. El porcentaje de duplicados del análisis secundario también ayuda a optimizar la concentración de carga; consulte Cluster Optimization Overview Guide.
Para obtener más orientación sobre las concentraciones de carga de la librería en los sistemas de Illumina, consulte el boletín PhiX loading concentrations for validation runs on Illumina sequencing platforms.